大村藩が倒幕運動を強くした背景には、大坂や江戸で学んだ上級藩士の子弟たちの動きがあります。少壮有為な渡辺清とその弟の渡辺昇、楠本正隆、長岡治三郎、松林飯山（はんざん）らです。彼らは新しい日本のためにと「勤王三十七士」の同盟を結成しました。

慶応3（1867）年、大村藩を揺るがした大村騒動という暗殺事件が起きますが、この事件を機に、大村藩には倒幕の意見が強くなったとされています。

攘夷運動を展開していた長州藩と薩摩藩は、元治元（1864）年の四国艦隊下関砲撃と文久3（1863）年の薩英戦争でともに外国軍隊の強さを痛感、強い国をつくるために倒幕の意見で一致します。大村藩の渡辺昇は江戸での遊学時代、桂小五郎ら長州の武士たちと知り合っており、この時の縁で坂本龍馬とともに薩長連合に一役果たしました。

結果、慶応2（1866）年薩長連合の盟約、翌年には倒幕の密勅が薩長に下り、同年、徳川慶喜は大政奉還を宣言しました。

しかし、幕府側を支持する大名も多く、慶応4（1868）年1月「鳥羽・伏見の戦い」が勃発、幕府側と倒幕派は戊辰戦争へと突入します。

戊辰戦争における倒幕派の主流は薩長両藩でしたが、大村藩は平戸藩兵とともに戦い大きな働きをしました。開戦の直前、東からの旧幕府軍の攻撃に備え、大村藩は近江国大津に兵50人を派遣。鳥羽・伏見の戦いは、兵士の数では圧倒的に旧幕府軍が有利でしたが、新式銃砲を装備した官軍が勝利し、旧幕府軍は敗走しました。

大村藩はこの後、薩摩藩から独立して東征軍の総督の指揮のもと、先鋒となって戦い東上。幕府軍の桑名城を受け取る大役を果たしています。

2月になると100人近くまで兵士を増やし、箱根の関所を奪取。関東に入って江戸城総攻撃の準備に備えました。

5月15日、1日にして彰義隊を討伐すると、抗戦を続ける東北諸藩との戦いへと進軍。会津の戦いでは佐賀・薩摩・松代の諸藩と連合して会津若松城を陥落させました。しかし東北諸藩は官軍に抵抗し、大村藩は東北で勤王倒幕派だった秋田藩の応援に入り、角館で庄内藩と戦いました。

少年兵を含む死傷者を出しましたが、やがて箱館戦争で戊辰戦争は終結しました。戊辰戦争における一連の戦いに対し、大村藩は3万石の賞典を受けましたが、これは2万7000石の大名に対するものとしては破格の多さでした。

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